1. 产品概述

本制品是采用SYBR^® Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。已经将热启动HotMaster Taq DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液、BSA和SYBR^® Green I等试剂预混成一种适合Real Time PCR反应检测用2×Premix Type试剂，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入模板、引物和水，便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。本品采用全新的Hotmaster Taq DNA 聚合酶，该酶不同于一般Hot-start 酶之处在于，一般的Hot-start 酶只在第一步温度升高之前封闭酶的活性，而Hotmaster Taq DNA 聚合酶是利用抑制剂通过温度调节方式封闭Hotmaster Taq DNA聚合酶的底物结合位点，温度低于40℃时，形成非活性的酶-抑制剂复合物，当温度升高至引物特异性的退火温度时，结合平衡向模板-特异性引物复合物形成方向移动，因此最大限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物产生，大大提高了荧光定量PCR反应的精确性。

2. 产品组分

组分

QP0605-01（100次）

QP0605-02（500次）

2×Universal SYBR qPCR Mix

1.0 mL

5×1.0 mL

3. 保存条件

-20 ℃ 避光保存至少12个月，使用前充分融解混匀。短期使用可放在4 ℃，避免反复冻融。

4. 适用场景

本产品适用于Real Time PCR反应检测。

5. 使用方法

5.1. 按如下建议配制体系反应液^[1]（以20，50 μL反应体系为例，反应液配制请在冰上进行）：

组分

体积（20 μL）

体积（50 μL）

2×Universal SYBR qPCR Mix

10

25

Forward Primer (10 μM)

0.4

1

Reverse Primer (10 μM)

0.4

1

Template DNA/cDNA

0.8

2

ddH₂O

Up to 20

Up to 50

[1] 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡；请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头，避免交叉污染和气溶胶污染。

5.2. 参考扩增程序^[2]

5.2.1  PCR循环（二步法）

步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

2 min

1

变性

95℃

15 sec

40

退火/延伸

60℃

30-34 sec

Dissociation Stage

5.2.2  PCR循环（三步法）

步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

2 min

1

变性

95℃

15 sec

40

退火

60℃

15-20 sec

延伸

72℃

20-30 sec

Dissociation Stage

[2] 本制品兼容性强，适用于不同厂家、型号的荧光定量PCR仪，绝大多数情况下使用二步法和三步法均可获得良好效果。在实际使用中可以根据机型推荐和具体情况对程序加以微调。一般来说，二步法扩增特异性高，三步法扩增效率高。如果融链曲线较差，可以尝试两步法扩增；若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。

6.  Q&A

A1:

无信号值出现

Q1:

1. 反应循环数不够。一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45 cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。

2. 检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

3. 引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性。

4. 引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。

5. 模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

6. 模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

A2:

Ct值出现过晚

Q2:

1. 扩增效率低，反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

2. PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

3. PCR产物太长。一般采用100-150 bp的产物长度，一般不超过500 bp。

A3:

标准曲线的线性关系不佳

Q3:

1. 加样存在误差，使得标准品不呈梯度。

2. 标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。

3. 引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针。

4. 模板中存在抑制物，或模板浓度过高。

7. 注意事项

1. 本制品含通用的染料ROX，具有高通用性，适合各种仪器。

2. 本制品含SYBR Green I 强光下易分解，降低敏感度，使用时避免长时间强光照射本制品。

3. 建议在冰上配制PCR反应液，再放入PCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性，减少背景。

4. 本制品含有4 mM MgCl₂（反应体系终浓度是2 mM Mg²⁺），可用25mM MgCl₂ 优化Mg²⁺浓度。

5. 本产品仅作科研用途。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。